Бактериологические исследования при сибирской язве
Бактериологическая диагностика сибирской язвы осуществляется микроскопическим исследованием, получением культур, заражением опытных животных и реакцией преципитации по Асколи.
Материалом для исследования обыкновенно елужит ухо или толстые мазки крови периферических сосудов трупа животного и, если произведено вскрытие, — кусочек селезенки.
У свиней исследуются лимфатические узлы области поражения (ретрофарингеальные, мезентериальные), селезенка и особенно инфаркты в ней.
При микроскопическом исследовании свежего материала для сибиреязвенных бацилл характерно:
1) расположение в виде коротких, иногда и длинных цепочек с вдавленными внутрь или резко обрубленными обращенными друг к другу концами у отдельных палочек;
2) положительная окраска по Граму и
3) наличие капсулы.
Для более ясной видимости капсулы мазки окрашивают по методу Романовского — Гимза, Ольта, Ребигера и др. Хорошие результаты получаются и при окраске фуксином Циля или синькой Леффлера в течение 2—3 мин. с последующим легким и быстрым смыванием краски водой, б последнем случае палочки окрашиваются в синий цвет, капсула — в розовокрасный.
Наличие перечисленных морфологических признаков при микроскопическом исследовании материала от трупа позволяет лаборатории предварительно диагносцировать сибирскую язву для немед ленного принятия соответствующих мер на месте согласно существующей инструкции.
Микроскопическое исследование разложившегося материала не дает ясной картины: наряду с характерными бациллами сибирской язвы видны как бы изъеденные, с закругленными концами палочки, без капсулы или только с обрывками ее.
Одновременно с микроскопическим исследованием производится посев патологического материала на агар в чашках Петри. Высевы из материала с признаками разложения производят после предварительного прогревания приготовленной в физиологическом растворе эмульсии в течение 30 мин. при 70°. Выросшие через 18—24 часа изолированно расположенные колонии изучают микроскопически при малом увеличении и из характерных для Вас. anthracis колоний (завитки волос) приготавливаются мазки и окрашиваются по Граму. Из этих же колоний производят отвивки на косой агар и бульон для получения чистых культур и, если представляется необходимым, приготавливают эмульсию в физиологическом растворе для последующего заражения лабораторных животных.
Для окончательного подтверждения диагноза производят подкожное введение мышам или морским свинкам материала (кровь, часть сосуда уха с кровью или частицами подкожной ткани, часть колонии), эмульгированного в физиологическом растворе. Привитые животные при наличии в материале Вас, anthracis Обычно погибают через 1—3 дня.
При вскрытии у лабораторных животных обнаруживают студенистый инфильтрат в ткани на месте прививки и увеличение селезенки. Обнаружение у павших животных типичных бацилл с капсулами и получение чистых культур из крови сердца, пульпы селезенки и инфильтрата окончательно подтверждают диагноз.
При получении отрицательных или неясных результатов выделения культуры и заражения опытных животных, особенно при исследовании сильно разложившегося материала, необходимо, для выяснения диагноза, проводить реакцию преципитации по Асколи.
С этой целью 1,0—2,0 измельченного материала заливают в пробирке или колбочке 10 мл физиологического раствора и прогревают в водяной бане 10—15 мин. при 100°. Полученный экстракт фильтруют до полной прозрачности и осторожно наслаивают на иммунную преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку, налитую в маленькую уленгутовскую пробирку. Появление сразу же или не позднее 15 мин. мутного беловатого кольца на границе двух жидкостей при отсутствии подобной реакции в контроле свидетельствует о наличии сибиреязвенной инфекции.
При бактериологической диагностике возбудителя сибирской язвы необходима диференциация его от антраксоподобных непатогенных бацилл.
В отличие от антраксоподобных бацилл характерным для Вас. anthracis является отсутствие гемолиза при росте на кровяном агаре (15—25%)
Дезинфекция птичников. Дезинфекция крольчатников -1
Дезинфекция питомников промысловых животных и служебных собак. Дезинфекция при заболеваниях пчел -2
Дезинфекция навоза -3
Дезинфекция почвы. Дезинфекция предметов ухода за животными и сбруи -4
Дезинфекция товарных вагонов -5
Дезинфекция шкур и шерсти -6
Дезинсекция -7
Дератизация — уничтожение грызунов -8
Патологоанатомическое вкрытие. Основные правила вскрытия трупов -9
Вскрытие трупов крупных жвачных, мелких животных и птиц -10
Протокол вскрытия. Порядок описания органов при вскрытии -11
Взятие, сохранени и пересылка материала для патологогистологического исследования -12
Техника изготовления патологоанатомических препаратов -13
Судебно-ветеринарное исследование трупов -14
Лабораторно-клиническая диагностика. Общие сведения по клинической диагностике -15
Исследование сердечно-сосудистой системы -16
Лихорадка -17
Исследование мочи. Физическое исследование мочи -18
Исследование мочи. Химическое исследование мочи -19
Исследование мочи. Химическое исследование мочи (продолжение) -20
Неорганизованные осадки мочи. Организованные осадки -21
Исследование крови -22
Физические свойства крови -23
Определение билирубина в сыворотке -24
Подсчет форменных элементов крови -25
Лейкоцитарная формула. Лейкоцитарный профиль -26
Методы исследования микробов. Бактериоскопический метод -27
Окраска препаратов -28
Исследование микробов в живом состоянии -29
Специальные среды -30
Специальные среды -31
Индикаторы -32
Способ фракционированных посевов на плотных питательных средах -33
Физиологические свойства микробов -34
Культивирование анаэробов -35
Метод заражения опытных животных -36
Подготовка животного и заражение его -37
Оборудование бактериологического кабинета -38
Бактериологическая диагностика важнейших инфекционных заболеваний. Сибирская язва -39
Бактериологическая диагностика эмфизематозного карбункула и злокачественного отека -40
Бактериологическая диагностика некробациллеза -41
Бактериологическая диагностика брадзота овец и инфекционной энтеротоксемии овец -42
Бактериологическая диагностика туберкулеза -43
Бактериологическая диагностика паратуберкулеза -44
Бактериологическая диагностика бруцеллеза -45
Бактериологическая диагностика туляремии -46
Бактериологическая диагностика пастереллеза — геморрагической септицемии (холеры кур, геморрагической септицемии свиней и прочих животных). Бациллярная рожа свиней -47
Бактериологическая диагностика диплококковой септицемии телят. Паратиф телят и поросят -48
Бактериологическая диагностика инфекционного аборта лошадей и мыта. Стригущий лишай -49
Бактериологическая диагностика лептоспироза -50
Бешенство. Материал для исследования -51
Взятие и пересылка патологического материала для исследования на инфекционные заболевания -52
Таблица. Лейкоцитарная формула домашних животных -53
Источник
Оглавление темы «Возбудитель сибирской язвы. Клинические проявления заражения сибирской язвой. Bacillus cereus.»: Микробиологическая диагностика сибирской язвы. Принципы микробиологической диагностики сибирской язвы. Бактериоскопический, бактериологический, биологический, кожно-аллергический метод диагностики сибирской язвы.Для микробиологической диагностики сибирской язвы берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбункула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные боксы или деревянные ящики. Выделение возбудителя сибирской язвы. Проводят окраску материала по Граму и посев на обычные питательные среды. Затем определяют подвижность микроорганизмов из выросших колоний, изучают их биохимические и культуральные свойства. Серологические исследования проводят для распознавания больных и реконвалесцентов. Возбудитель сибирской язвы можно выявлять AT, меченными флюоресцеинами (особенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РИГА и ИФА. Кожные пробы применяют для ретроспективной диагностики при эпидемиологических исследованиях. Проводят внутрикожное введение 0,1 мл бактериального аллергена (антраксина).
Реакция термопреципитации по Асколи имеет большое значение, так как позволяет идентифицировать возбудителей сибирской язвы при отрицательных результатах бактериологических исследований. Для прижизненной же диагностики эта реакция не имеет серьёзных преимуществ перед вышеуказанными бактериологическими и серологическими методами. Фаготипирование сибирской язвы. Для дифференциальной диагностики предложены высокоспецифические литические сибиреязвенные бактериофаги «ВА-9» и «Саратов». Биологическая проба при диагностике сибирской язвы. Заражение лабораторных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки и кролики— через 2-4 сут. При выживании животных наблюдение за ними продолжают в течение 10 дней. У павших животных исследуют печень, селезёнку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца и места введения заразного материала. Затем проводят посев исследуемого материала на питательные среды. — Также рекомендуем «Лечение сибирской язвы. Профилактика сибирской язвы. Иммунопрофилактика сибирской язвы. Ветеринарно-санитарные меры профилактики сибирской язвы. Санитарный надзор за сибирской язвой.» |
Источник
Таблица 38 — Дифференцирующие признаки видов рода Proteus
| Тесты | P.vulgaris | P.mirabilis | P.mixofaciens |
| Образование индола | + | — | — |
| Реакция Фогеса-Проскауера | — | X | + |
| Цитрат Симмонса | X | X | + |
| Орнитиндекарбоксилаза | — | + | — |
| Образование кислоты из: | |||
| мальтозы | + | — | + |
| ксилозы | X | + | — |
| а-метилглюкозида | X | — | + |
| Просветление среды с тирозином | + | + | — |
| Образование вязкой пленки | — | — | + |
Приготовленной суспензией заражают внутрибрюшинно трех белых мышей живой массой 14-16 г в дозе 0,5 млрд. микробных клеток
(0,5 см3). Патогенность считают установленной, а изучаемые штаммы протея относят к возбудителю болезни в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения.
Сибирская язва (Anthrax) — остропротекающая болезнь, характеризующаяся признаками септицемии, интоксикации, образованием карбункулов. К сибирской язве восприимчивы крупный рогатый скот, лошади, другие однокопытные, верблюды, олени, дикие травоядные всех видов. Менее чувствительны свиньи, плотоядные — малочувствительны.
Возбудителем болезни является грамположительная, спорообразующая палочковидная бактерия — Bacillus anthracis, род Bacillus.
Лабораторная диагностика основана на выделении и идентификации культуры возбудителя, в случае необходимости проводят обнаружение антигенов возбудителя в исследуемом материале.
Бактериологическое исследование. Материал для исследования. Прижизненно у больного животного берут кровь (обычно из уха). Капли крови наносят в виде толстого мазка на предметные стекла, подсушивают, стекла складывают мазками внутрь, помещают между ними спички. От трупа животного берут ухо или мазок крови из сосудов уха. От трупов свиней — участки отечной соединительной ткани, заглоточные, подчелюстные и другие лимфатические узлы, при наличии в них изменений. Ухо отрезают со стороны, на которой лежит труп, предварительно перевязав двумя лигатурами, между которыми делают разрез. Место отреза прижигают. Если подозрение возникло в ходе вскрытия трупа (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают, для исследования берут кусочки селезенки, печени, измененные лимфатические узлы. Материал помещают в стеклянную посуду (банки, пробирки). Мазки после высушивания кладут в чашки Петри, последние завертывают в бумагу, на ней делают надпись «Мазок нефиксирован!». Посуду с материалом помещают во влагонепроницаемую тару, опечатывают и нарочным с соответствующим сопроводительным документом направляют в лабораторию. Для обнаружения возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды отбор материала и ход бактериологического исследования регламентирован соответствующими методическими указаниями.
Микроскопическое исследование исходного материала. Проводят путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму, а также одним из методов на капсулу: метиленовым синим Леффлера, по Романовскому — Гимза, Михину, Ольту, Ребигеру. Учитывая опасность исследуемого материала для бактериолога, рекомендуется фиксировать мазки этиловым спиртом с перекисью водорода, что обеспечивает инактивацию возбудителя. С этой целью подсушенные на воздухе мазки выдерживают 30 минут в фиксирующей жидкости: 180 мл этанола 96° и 20 мл 30%-ного пергидроля.
Возбудитель в мазках, окрашенных по Граму, представляет крупную грамположительную палочку (5-10 х 1-2 мкм) с закругленными концами (одиночные клетки). В материале клетки располагаются преимущественно в виде коротких цепочек, попарно. Концы клеток, обращенные друг к другу, имеют обрезанные под прямым углом концы. В материале от свиней форма клеток может быть атипичной: короткие, толстые или изогнутые палочки, иногда зернистые со вздутием на конце или середине клетки. В несвежем материале лизис клеток может привести к обнаружению в мазках «теней микробов», представляющих более устойчивые к гниению капсулы возбудителя. В препаратах, окрашенных специальными методами, клетки окружены капсулой, у парных клеток и в коротких цепочках она общая для нескольких клеток. При окраске метиленовым синим Леффлера клетки синего цвета окружены розовым капсулярным материалом, что считается характерным для B.anthracis. В мазке, окрашенном по методу Гимзы, капсулы бледномалинового цвета.
В организме животного, в невскрытых трупах возбудитель споры не образует, для их формирования необходимы: доступ кислорода, температура 26-30° С, нейтральная или слабощелочная реакция окружающей среды.
В мазках из материала при микроскопическом исследовании могут быть обнаружены клетки морфологически сходных бактерий, например — C.perfringens (крупные, грамположительные, капсулообразующие).
Клетки В. anthracis могут быть дифференцированы от C.perfringens окраской препаратов по Романовскому. При этом капсула В. anthracis имеет почти прямоугольную форму, четкий контур, красно-лиловый цвет, а капсула С. perfringens имеет овальную форму и голубой цвет.
При наличии сибиреязвенных люминесцирующих сывороток препараты окрашивают ими в прямом варианте МФА. Имеющиеся люминесцентные сыворотки дают перекрестные реакции с В. cereus. Обнаружение в мазках светящихся клеток позволяет подозревать наличие в материале возбудителя сибирской язвы.
Источник
Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6.
Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы
Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь |
Серологический метод
Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного
Аллергодиагностика |
Выявление сибиреязвенного антигена | |||
Микроскопический метод.Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных бацилл в виде цепочек дает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся желто-зеленым ободком (рис. 11 б.).
Бактериологический метод —посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный материал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 370 С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы медузы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» — рис. 12. В бульоне характерен придонный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается прозрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (расположение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выделения чистой культуры типичные колонии пересевают на скошенный МПА.
Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3%голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 370 С в атмосфере 5-7% СО2.
А б
Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы(Bacillus anthracis). а — окраска по Граму, б – РИФ. х630
Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56
Идентификацию выделенной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к антибиотикам.
Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья».На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-часовую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 370 С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные бациллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.
Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.
Наличие сибиреязвенного антигенав разложившемся трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакциитермопреципитациипо Асколи.Исследуемый материал измельчают, заливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.
Биопроба.Исследуемымматериалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаруживают типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.
Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл
| Признак | Вид микроорганизмов | |||||
| Bacillus anthracis | Bacillus cereus | Bacillus mycoides | Bacillus thuringiensis | Bacillus subtilis | Bacillus Megaterium | |
| Капсула | + | — | — | — | — | — |
| Подвижность | — | + | — | + | + | + |
| Гемолиз | — | + | — | + | — | + |
| Рост в анаэробных условиях | + | + | + | + | — | — |
| Лецитиназа | + | + | + | + | — | — |
| Аргининдегидролаза | — | V | V | + | — | — |
| Нитpaтpeдyктaзa | + | + | + | + | + | — |
| Патогенность для мышей | + | — | — | — | — | — |
| Ферментация до кислоты: | ||||||
| глицерина | — | V | + | + | + | + |
| маннита | — | — | — | — | + | + |
| салицина | — | V | + | + | + | + |
Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «V» — вариабельная реакции.
Серологический методвыполняетсяв тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.
Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы — антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.
Источник