Диагностика сибирской язвы у животных методом пцр
Сибирская язва (Anthrax) — зооантропоноз. К ней восприимчивы
животные многих видов, особенно травоядные, и человек. Болезнь протекает преимущественно
остро с явлениями септицемии или с образованием различной величины карбункулов.
Регистрируют в виде спорадических случаев, возможны энзоотии и эпизоотии.
Возбудитель сибирской язвы — Bacillus anthracis (Cohn, 1872) — относится
к семейству Bacillaceae.
Bacillus
anthracis неподвижная, грамположительная (в молодых и старых культурах
встречаются и грамотрицательные клетки), образующая капсулу (в организме или
при культивировании на искусственных питательных средах с большим содержанием
нативного белка и СО2) и спору палочка, размером 1-1,3 х 3,0-10,0 мкм. При
температуре ниже 12 и выше 42 оС, а также в живом организме или невскрытом
трупе, в крови и сыворотке животных споры не образуются. В окрашенных препаратах
из крови и тканей больных или погибших от сибирской язвы животных бактерии
располагаются одиночно, попарно и в виде коротких цепочек по 3-4 клетки; концы
палочек, обращенных друг к другу, прямые, резко обрубленные, свободные — слегка,
закругленные. Иногда цепочки имеют форму бамбуковой трости.В мазках из культур
на плотных и жидких питательных средах палочки располагаются длинными цепочками.
Культивирование.
Bacillus
anthracis по способу дыхания относят к факультативным анаэробам, хорошо
растет на универсальных средах (МПБ, МПА, МПЖ, картофеле, молоке).Оптимальная
температура роста на МПА 35-37oС, в бульоне 32-33oС.
При температуре ниже 12 и выше 45oС не растет. Оптимум рН сред
7,2-7,6. На поверхности МПА в аэробных условиях при температуре 37oС
17-24-часовые культуры состоят из серовато-беловатых тонкозернистых с серебристым
оттенком, похожих на снежинки колоний, имеющих шероховатый рельеф и характерных
для типичных вирулентных штаммов (R-форма). Диаметр колоний не превышает 3-5
мм.На сывороточном агаре и свернутой лошадиной сыворотке в присутствии 10-50%
углекислоты колонии гладкие полупрозрачные (S-форма), а также слизистые (мукоидные),
тянущиеся за петлей (М-форма), состоящие из капсульных палочек.В МПБ Bacillus
anthracis через 16-24 ч на дне пробирки образует рыхлый белый осадок,
надосадочная жидкость остается прозрачной, при встряхивании бульон не мутнеет,
осадок разбивается на мелкие хлопья (R-форма).При посеве в столбик желатина
на 2-5-е сут появляется желтовато-белый стержень. Культура напоминает елочку,
перевернутую верхушкой вниз. Постепенно верхний слой желатин начинает разжижаться,
принимая сначала форму воронки, затем мешочка.Bacillus anthracis
при росте в молоке вырабатывает кислоту и через 2-4 дня свертывает его и пептонизирует
сгусток.Возбудитель хорошо размножается в 8-12-суточных куриных эмбрионах,
вызывая их гибель на 2-4 дней с момента заражения.
Биохимические свойства.
Ферменты Bacillus anthracis: липаза, диастаза, протеаза, желатиназа,
дегидраза, цитохромоксидаза, пероксидаза, каталаза, лецитиназа и др.Ферментирует
с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу
и декстрин. На средах с глицерином и салицином возможно слабое кислотообразование.
Арабинозу, рамнозу, галактозу, маннозу, раффинозу, инулин, маннит, дульцит,
сорбит, инозит не сбраживает. Утилизирует цитраты, образует ацетилметилкарбинол
(реакция Фогеса — Проскауэра положительная). Выделяет аммиак. Редуцирует метиленовый
синий и восстанавливает нитраты в нитриты. Некоторые штаммы образуют сероводород.
Токсинообразование.
Bacillus anthracis образует сложный экзотоксин, состоящий из трех
компонентов: эдематогенный фактор (ЕF), протективный антиген (РА) и летальный
фактор (LF) или факторы I, II, III. Эдематогенный фактор вызывает местную
воспалительную реакцию — отек и разрушение тканей. Протективный антиген —
носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием. Летальный
фактор в смеси со протективным вызывает гибель крыс, белых мышей и морских
свинок.Каждый из трех факторов обладает выраженной антигенной функцией и серологически
активен.Инвазивные свойства микроба обусловлены капсульным полипептидом d-глутаминовой
кислоты и экзоферментами.
Антигенная структура.
В состав антигенов Bacillus anthracis входят неиммуногенный соматический
полисахаридный комплекс и капсульный глутаминполипептид. Полисахаридный антиген
не создает иммунитета у животных и не определяет агрессивных функций микроорганизма.
Устойчивость.
В невскрытом трупе вегетативная клетка микроба разрушается в течение 2-3
сут, в зарытых трупах сохранятся до 4 дней. В замороженном мясе при минус
15oС жизнеспособна 15 дней, в засоленном мясе — до 1,5 мес. В навозная
жиже, смешанной с сибиреязвенной кровью, погибает через 2-3 ч, споры же остаются
в ней вирулентными в течение месяцев. В запаянных ампулах с бульонными культурами
могут оставаться жизнеспособными и вирулентными до 63 лет, в почве — более
50 лет.Спирт, эфир, 2 %-ный формалин, 5 %-ный фенол, 5-10 %-ный хлорамин,
свежий 5 %-ный раствор хлорной извести, перекись водорода разрушают вегетативные
клетки в течение 5 мин. Этиловый спирт 25-100 % убивает споры в течение 50
дней и более, 5 %-ный фенол, 5-10%-ный раствор хлорамина — от несколько часов
до нескольких суток, 2 %-ный раствор формалина — через 10-15 мин, 3%-ный раствор
перекиси водорода — через 1 ч, 4 %-ный раствор перманганата калия — через
15 мин, 10 %-ный раствор гидроокиси натрия — через 2 ч.Вегетативные клетки
при нагревании до 50-55oС гибнут в течение 1 ч, при 60 oС
— через 15 мин, при 75 oС — через 1 мин, при кипячении — мгновенно.При
медленном высушивании наступает спорообразование и микроб не гибнет. При минус
10oС бактерии сохраняются 24 дня, при минус 24oС — 12
дней.Воздействие прямого солнечного света обезвреживает бактерии через несколько
часов.Сухой жар при температуре 120-140oС убивает споры через 2-3
ч, при 150oС — через 1 ч, текущий пар при 100oС — через
12-15 мин, автоклавирование при 110oС — за 5-10 мин, кипячение
— через 1 ч.Возбудитель сибирской язвы проявляет высокую чувствительность
к пенициллину, хлортетрациклину и левомицетину, а также к лизоциму. Бактериостатическим
эффектом на протяжении 24 ч обладает свежевыдоенное молоко коров.
Патогенность.
К возбудителю сибирской язвы восприимчивы все виды млекопитающих. Чаще болеют
овцы, крупный рогатый скот, лошади, козы, буйволы, верблюды и северные олени,
могут заражаться ослы и мулы. Свиньи менее чувствительны. Среди диких животных
восприимчивы все травоядные. Известны случаи заболевания собак, волков, лисиц,
песцов, среди птиц — уток и страусов.
Патогенез.
Заражение животных происходит преимущественно алиментарно. Через поврежденную
слизистую пищеварительного тракта микроб проникает в лимфатическую систему,
а затем в кровь, где фагоцитируется и разносится по всему организму, фиксируясь
в элементах лимфоидно-макрофагальной системы, после чего снова мигрирует в
кровь, обусловливая септицемию.Капсульное вещество ингибирует опсонизацию,
в то время как экзотоксин разрушает фагоциты, поражает центральную нервную
систему, вызывает отек, возникает гипергликемию и повышается активность щелочной
фосфатазы.В терминальной фазе процесса в крови снижается содержание кислорода
до уровня, несовместимого с жизнью.
Лабораторная диагностика.
Для лабораторного исследования на сибирскую язву направляют ухо павшего животного.
Бактериоскопия. Из патологического материала для микроскопии готовят
мазки, часть красят по Граму и обязательно на капсулы по Михину и Ольту. Обнаружение
типичных по морфологии капсульных палочек является важным диагностическим
признаком.Посев на питательные среды. Исходный материал засевают в МПБ и на
МПА (рН 7,2-7,6), инкубируют посевы при температуре 37oС в течение
18-24 ч, при отсутствии роста их выдерживают в термостате еще 2 сут.Биологическая
проба. Осуществляется на белых мышах, морских свинках, кроликах, одновременно
с посевом материала на питательные среды. Белых мышей заражают подкожно в
заднюю часть спины (по 0,1-0,2 мл), морских свинок и кроликов — под кожу в
область живота (по 0,5-1,0 мл). Мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки
и кролики — через 2-4 сут. Павших животных вскрывают, делают мазки и посевы
из крови сердца, селезенки, печени и инфильтрата на месте инъекции исследуемого
материала.Идентификация. Возбудителя сибирской язвы следует дифференцировать
от сапрофитных бацилл: B. cereus, B. megaterium, B. mycoides и B.
subtilis на основе главных и дополнительных признаков. К главным признакам
относятся патогенность, капсулообразование, тест «жемчужного ожерелья», лизабельность
фагом, иммунофлюоресцентный тест. Дополнительными являются подвижность, отсутствие
гемолиза, лецитиназная активность, образование фосфатазы.
| Тест | B. anthracis | B. cereus, B. megaterium, B. mycoides, B. subtilis |
|---|---|---|
| Патогенность | Патогенна для лабораторных животных | Не патогенны для лабораторных животных, за исключением B.cereus (при внутрибрюшинном заражении белых мышей). |
| Капсулообразование | Образует массивную с четкими контурами капсулу. | Капсулу не образуют. |
| «Жемчужное ожерелье» | На агаре с пенициллином возбудитель растет в виде цепочек, состоящих из шарообразных форм, напоминающих ожерелье из жемчуга. | Феномен «жемчужного ожерелья» отсутствует. |
| Лизабельность фагом | Лизируется сибиреязвенный фагом. | Лизис сибиреязвенный фагом отсутствует. |
| Иммунофлюоресцентный тест1 | Положительный | Отрицательный |
| Подвижность | Неподвижна | Подвижны |
| Гемолитеческая активность2 | Как правило не гемолизирует эритроциты барана, или лизирует очень медленно. | Гемолизируют эритроциты барана.
|
| Лецитиназная активность | Желток куриного яйца свертывает медленно или вообще не свертывает (левый сектор) | B.cereus интенсивно синтезирует лецитиназу (верхний сектор) |
| Образование фосфатазы | Отсутствует | Имеется |
1 — ориентировочный метод и требует дополнительного
изучения вирулентности, капсулообразования, фагочувствительности.
2 — признак вариабелен у разных штаммов.
Серологическое исследование.
Для обнаружения сибиреязвенных антигенов при исследовании кожевенного и мехового
сырья, загнившего патологического материала, а также свежего патологического
материала и серологической идентификации выделенных культур применяют реакцию
преципитации по Асколи.В качестве серологического теста, главным образом для
изучения антигенного спектра Bacillus anthracis, применяют реакцию диффузионной
преципитации (РДП).Для выявления свежих случаев и ретроспективной диагностики
сибирской язвы у человека предложен аллерген антраксин (Э. Н. Шляхов, 1961).
Им выявляют и специфическую поствакцинальную сенсибилизацию у сельскохозяйственных
животных.
Иммунитет.
Формирование иммунитета инфекции по типу антитоксического обуславливает протективный
антиген.В настоящее время защитные антитела обнаружены при помощи РСК, РДП
и непрямого варианта метода флюоресцирующих антител.В результате естественного
заражения и переболевания сибирской язвы у животных возникает длительный иммунитет.С
целью активная защита животных от сибирской язвы применяют живые споровые
сибиреязвенные вакцины: вакцина СТИ (иммунитет наступает через 10 дней и длится
не менее 12 мес), вакцина из штамма № 55 (иммунитет наступает через 10 дней
и сохраняется не менее 1 года).Для лечения и пассивной профилактики применяют
противосибиреязвенную сыворотку и глобулин. Иммунитет наступает через несколько
часов и сохраняется до 14 дней.
Источник
Характеристики
Принцип работы
Подтверждение качества
Тест-система «ГенТест Сибирская язва» предназначена для выявления ДНК бактерий Bacillus anthracis в биологическом материале и кормах для животных методом полимеразной цепной реакции c детекцией результатов в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ).
Отличительные особенности набора «ГенТест Сибирская язва»:
- Простота работы: минимальное количество манипуляций как на стадии выделения ДНК, так и при постановке ПЦР, что значительно упрощает работу оператора и увеличивает поточность проводимых исследований;
- Высокая скорость анализа: от поступления пробы до результата затрачивается не более 80 мин, благодаря использованию экспресс метода выделения ДНК и ДНК-полимеразы нового поколения;
- Низкая себестоимость анализа: большая экономия из-за существенного сокращения самой трудоемкой стадии анализа — выделения ДНК. Более того, сокращается потребление расходных материалов (пробирок, наконечников);
- Качественная техническая поддержка: консультация специалистов по всем возникающим вопросам.
Инструкция к тест-системе «ГенТест Сибирская язва»
Комплектация тест-системы «ГенТест Сибирская язва» рассчитана на проведение 55 анализов, включая контроли, и указана в таблице 1.
Таблица 1. Состав набора «ГенТест Сибирская язва»:
| Состав | Комплектация |
| 1. ПЦР-реагент | 1 пробирка – 0,71±0,02 мл |
| 2. Праймеры СЯ | 1 пробирка – 0,42±0,02 мл |
| 3. ПКО | 1 пробирка – 0,5±0,02 мл |
| 4. ОКО | 1 пробирки – 0,5±0,02 мл |
| 5. ВКО | 1 пробирка – 0,57±0,02 мл |
Лимит детекции тест-системы составляет не менее 5 геном-эквивалентов возбудителя в реакции ПЦР.
Для этапа экстракции ДНК из образца рекомендуется использование наборов для очистки ДНК «АртДНК экспресс», «АртДНК легкий» или «АртДНК».
Размеры упаковки:
- маленькая: 9,5 × 5,5 × 2,5 см
- большая: 11,5 × 9,5 × 4,5 см
Транспортировка и хранение набора:
Немаловажным фактором, влияющим на качество, является соблюдение норм транспортировки и хранения.
Компания Альгимед осуществляет транспортировку и хранение тест-систем соблюдая требования и правила производителя, в том числе и такие как рекомендованный температурный режим.
Транспортировка: при температуре +2 – +8 оС в течение не более 30 суток или при температуре менее 30 °С в течение суток. Тест-системы «ГенТест Сибирская язва» транспортируют любым видом транспорта в условиях, обеспечивающих их сохранность, в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.
Хранение: в упаковке изготовителя при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. Допускается хранение всех компонентов набора при температуре +2 – +8 °С в течение 90 дней. Допускается заморозка/оттаивание компонентов тест-системы до 10 раз. Срок годности тест-системы «ГенТест Сибирская язва» – 12 месяцев с даты изготовления.
Метод обнаружения ДНК возбудителя основан на экстракции общей ДНК из биологического материала совместно с экзогенным ВКО и проведении амплификации полученной ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени». Результат амплификации ДНК возбудителя регистрируется на канале «HEX/Yellow», результат амплификации внутреннего контроля регистрируется на канале флуоресценции «FAM/Green».
I. Оборудование и материалы:
ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах). Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
ЗОНА 1 – Для экстракции ДНК из исследуемого материала. Оборудуется в соответствии с критериями фирмы-производителя наборов для выделения ДНК.
ЗОНА 2 – Для проведения амплификации ДНК:
- амплификатор с детекцией результатов в режиме «реального времени» на каналах FAM/Green и HEX/Yellow;
- ПЦР-бокс;
- центрифуга/вортекс;
- набор дозаторов переменного объема;
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл;
- одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл;
- оптические пробирки объемом 0,2 мл;
- штативы для пробирок объемом 0,2 мл и 1,5 мл и наконечников;
- холодильник от +2 °С до +8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- емкость для сброса наконечников;
- комплект средств для обработки рабочего места.
II. Проведение анализа:
1. Выделение ДНК
Производится в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя набора для выделения ДНК.
2. Подготовка ПЦР-смеси
- Разморозить все реагенты (при необходимости), перемешать (перевернув
пробирки несколько раз) и сбросить капли с помощью кратковременного
центрифугирования. - В пробирке объемом 1,5 мл приготовить «Мастер Микс»: из расчета на N
выделений смешать 12,5*(N+1) мкл ПЦР-реагента и 7,5*(N+1) мкл праймеров,
аккуратно перемешать, разнести по 20 мкл в пробирки для проведения ПЦР. - Используя наконечник с фильтром добавить по 5 мкл ДНК исследуемых
образцов, а также отрицательный и положительный контроли экстракции (ОКЭ и
ПКЭ соответственно) и амплификации (К+ и К-: по 5 мкл ПКО и ОКО
соответственно). Герметично закрыть пробирки крышками. В случае наличия
пузырьков в растворе или капель на стенках пробирок – удалить кратковременным
центрифугированием.
3. Постановка реакции амплификации
- Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в
амплификатор. - В соответствии с инструкцией к прибору, запрограммировать
амлификатор, согласно таблице 2.
Таблица 2. Параметры амплификации:
| Шаг | Температура, °C | Время | Кол-во циклов |
| Начальная денатурация | 95 | 2 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 5 сек | 10 |
| Отжиг/Элонгация | 60 | 15 сек | |
| Денатурация | 95 | 5 сек | 30 |
| Отжиг/Элонгация/Детекция по каналам FAM/Green, HEX/Yellow | 60 | 15 сек |
- В соответствии с инструкцией к прибору запрограммировать положение пробирок в амплификаторе. Также допускается выполнять данный шаг во время проведения амплификации или по ее окончанию, если это позволяет ПО прибора.
- Дать название эксперименту и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента). Запустить амплификатор*.
*Для приборов «Rotor-Gene» перед запуском выбрать функцию: «Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimization Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для обоих каналов установить параметры «Min Reading/Миним. Сигнал» – 5Fl и «Max Reading/Максим. Сигнал» – 10Fl.
III. Анализ результатов:
1. Перед началом анализа необходимо задать настройки в соответствии с инструкцией к прибору.
а) для приборов типа «Rotor-Gene»:
- активировать функции «Dynamic tube/Динамич.фон» и «Slope Correct/Коррек. Уклона»;
- установить значение параметра выбросов («NTC threshold/Порог Фона») – 10%. При необходимости порог фона может быть изменен в диапазоне 0–30 %*;
- установить значение параметра пороговой линии («Threshold/Порог») – 0,02. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 0,02–0,2*.
б) для приборов «Bio-Rad CFX 96»:
- активировать функции «Apply Fluorescence Drift Correction» и «Baseline Subtracted Curve fit»;
- установить значение параметра пороговой линии («Single Threshold») – 50. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 25–250*.
*Необходимость корректировки выбросов возникает в случаях сильных колебаний флуоресценции в отдельных пробах.
Примечание: в зависимости от установленной версии программного обеспечения названия команд могут несколько отличаться.
2. Выбрать логарифмическую шкалу для отражения результатов и визуально проконтролировать пересечение пороговой линии в линейной части роста кривой амплификации. При пересечении пороговой линии с кривой амплификации не в линейном участке – переместить ее вручную до необходимого уровня.
Результаты анализа интерпретируются на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (что соответствует наличию/отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).
3. Удостовериться, что ПЦР-исследование валидно: контрольные точки анализа должны соответствовать значениям, приведенным в таблице 3.
В случае не соответствия контрольных точек требуемым значениям – анализ необходимо переделать начиная со стадии экстракции ДНК.
Таблица 3. Оценка результатов анализа контрольных точек:
Контрольная | Контролируемый | Значение «Сt» | Значение «Сt» |
| ОКЭ | Экстракция ДНК | – | + |
| ПКЭ | Экстракция ДНК | + | + |
| К- | ПЦР | – | – |
| K+ | ПЦР | + | + |
4. Интерпретировать результаты ПЦР-анализа исследуемых образцов в соответствии с таблицей 4.
Таблица 4. Интерпретации результатов образцов:
Результат образца | Значение «Сt» | Значение «Сt» |
| Положительный | + (Ct≤24) | +/– |
| Сомнительный | + (Ct>24) | + |
| Отрицательный | – | + |
| Невалидный | – | – |
5. В случае сомнительного образца (Ct > 24) требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа выделения ДНК. Требуется параллельно провести исследование смывов с поверхностей в лаборатории для исключения внутрилабораторной контаминации. В случае повторного получения положительного результата по каналу «HEX/Yellow» и отрицательного результата исследования смывов, образец считать положительным.
В случае невалидного образца требуется повторно провести ПЦРисследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК с использованием сорбентного метода пробоподготовки.
IV. Проблемы при работе и методы их устранения:
Таблица 5. Проблемы при работе и методы их устранения:
Проблема | Возможная причина проблемы | Варианты решения проблемы |
Нет сигнала по каналу «FAM/Green» или значение Сt>24 | Использование неподходящих расходных материалов | используйте оптические пробирки для постановки ПЦР, рекомендованные фирмой-производителем амплификатора либо адаптированные для используемого прибора* |
ПЦР ингибирование | разведите образец в 5 раз в воде, повторите анализ | |
| используйте новый образец материала | ||
| используйте сорбентный метод выделения ДНК | ||
Нет сигнала в К+ | Некорректное приготовление ПЦР-смеси | аккуратно приготовьте новую ПЦР-смесь |
Некорректные параметры амплификации | установите параметры амплификации в соответствии с таблицей 2 | |
Некорректные условия хранения наборов | используйте наборы, которые хранились в надлежащих условиях | |
Наличие сигнала по каналу «HEX/Yellow» в К- и/или ОКЭ | Контаминация | — проведите деконтаминационные процедуры; — используйте новые наборы |
* для приборов Rotor-Gene допустимо использование ПЦР пробирок фирмы-производителя прибора (Qiagen, кат. номер 981005, 981008, 981103, 981106 и др.), а также адаптированный пластик (Axygen, кат. номер PCR-0104-C).
Тест-система имеет Декларацию о соответствии, выданную в Российской Федерации.
Каждая тест-система в комплекте поставки содержит Сертификат качества от производителя.
Источник