Исследование кожи на сибирскую язву
Реакцию преципитации применяют для диагностики сибирской язвы как при исследовании кожевенного сырья в лабораториях Асколи, так и в диагностических бактериологических лабораториях, как подсобную реакцию при бактериологических исследованиях на сибирскую язву.
Исследование кожевенного сырья на сибирскую язву при помощи реакции преципитации ведут холодным способом после предварительной стерилизации взятых проб. Доставленные в лабораторию пробы стерилизуют в автоклаве при 11/2 атмосферах в течение получаса или при 1 атмосфере в течение одного часа. После стерилизаций пробы охлаждают и затем измельчают. Измельчённые пробы должны быть весом не менее 1 г. Нумерация банок должна соответствовать номерам проб.
Экстрагирование проб производят холодным способом в материальных банках ёмкостью до 50 г.
Пробы от свиных шкур экстрагируют горячим способом в пробирках на водяной бане при кипячении в течение 30 минут.
Экстрагирующая жидкость разливается в отношении 1 : 10. В качестве экстрагирующей жидкости берут физиологический раствор (0,85% очищенной поваренной соли), к которому добавляют 0,3 о/о кристаллической карболовой кислоты для предотвращения роста бактерий и получения легко фильтруемых, прозрачных экстрактов. Лучшая температура для экстрагирования 8—14° С. Добавление карболовой кислоты особенно необходимо при температуре помещения от 14 до 20°С. Продолжительность экстрагирования—от 16 до 20 часов.
Экстракты фильтруют через воронки в укороченные бактериологические пробирки. В качестве фильтра употребляют асбестовую вату (нейтральную). Экстракты после фильтрации должны быть прозрачны. Если полученный фильтрат мутный, то допускается вторичная фильтрация экстрактов. При этом первую порцию второго фильтрата, который может содержать малое количество преципигиногена, выбрасывают.
Порядок применения сыворотки. Перед употреблением сыворотка должна быть проконтролирована посредством стандартного антигена и экстракта из заведомо сибиреязвенного материала (желателен материал такого же рода, как подвергаемый исследованию). Сыворотка должна давать ясно положительную реакцию через 30 секунд (до 1 минуты) со стандартным антигеном и до 5 минут—с экстрактом из заведомо сибиреязвенной кожи.
Лаборатории, применяющие преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, должны иметь в своём распоряжении не менее 2—3 различных серий для взаимного контроля. Кожи, давшие положительную или сомнительную реакции на сибирскую язву, должны быть повторно экстрагированы и проверены повторно с двумя—тремя различными сериями сывороток. Сыворотка, употребляемая для реакции, должна быть прозрачной. Из фладсонов, с хорошо отстоявшейся сывороткой, возможно применение её без предварительного филь-трования при условии осторожного насасывания, без взбалтывания осадка на дне флакона. Сыворотки, имеющие муть даже после фильтрования через асбест, не должны применяться. Нельзя также применять сыворотки непосредственно после транспортировки или взбал-тывания их. В таких случаях сыворотке нужно дать отстояться не менее 10—15 дней, так как фильтрование не даёт той прозрачности, какая достигается путём отстоя. Сыворотка должна транспортироваться в тёплое время года (с 1 апреля по 1 ноября). В зимнее время сыворотку следует пережить в условиях, исключающих замораживание (в тёплом вагоне), так как тёплая упаковка {вата, войлок) не гарантируют от замораживания.
Соединение компонентов. Компоненты при реакции преципитации соединяют наслаиванием профильтрованных прозрачных экстрактов на разлитую и проконтролированную преципитирующую сыворотку. Сыворотку и экстракт для реакции берут по 0,25—0,3 см3. Можно наслаивать экстракт на разлитую сыворотку или подслаивать сыворотку под экстракт пастеровской пипеткой. Реакцию учитывают в зависимости от активности преципитирующей сыворотки в течение 10—15 минут. Реакцию с экстрактами из мокросолёного и сухосолёного сырья учитывают в течение 20 минут.
Диагностическую оценку реакции производят при проходящем свете на чёрном фоне. В тех пробирках, где граница между, сывороткой и экстрактами нерезко выражена, реакцию не учитывают и ставят вновь с тем же экстрактом.
Если материал был сибиреязвенным, то на месте соприкосновения экстракта с сывороткой через 1—15 минут появляется различной резкости серовато-белый диск (кольцо).
При сомнительных реакциях исследование повторяют. В тех случаях, когда вторично получается сомнительная реакция, исследуемая кожа считается сибиреязвенной.
Вся посуда для реакции преципитации должна быть чистой, прозрачной. Посуду промывают в тёплой солёной (1—2 о/о поваренной соли) воде при помощи волосяных ершей и щёток с последующим промыванием в чистой воде. Улелгутовские пробирки промывают в дестиллированной воде. После мытья посуду просушивают.
Ежедневно перед началом работы ставят следующие контроли:
а) преципитирующие сыворотки и стандартный антиген или экстракт из заведомо сибиреязвенной кожи (реакция положительная);
б) преципитирующие сыворотки и экстракт из заведомо здоровой кожи (реакция отрицательная);
в) нормальная сыворотка и экстракт из заведомо сибиреязвенной кожи или стандартный антиген (реакция отрицательная);
г) преципитирующая сыворотка и экстрагирующая жидкость (реакция отрицательная).
При исследовании методами преципитации лаборатория должна сообщить о положительных реакциях старшему районному (городскому) ветеринарному врачу, в район, откуда материал поступил на исследование.
Метки: мыте
Источник
МУК 4.2.2413-08
Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы
| Обозначение: | МУК 4.2.2413-08 |
| Обозначение англ: | MUK 4.2.2413-08 |
| Статус: | действует |
| Название рус.: | Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы |
| Дата добавления в базу: | 01.02.2017 |
| Дата актуализации: | 01.02.2020 |
| Дата введения: | 01.09.2008 |
| Область применения: | Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций. В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания |
| Оглавление: | 1. Область применения 2. Нормативные и методические ссылки 3. Общие положения 4, Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования 5. Порядок проведения исследования 6. Выдача заключений по результатам лабораторного исследования на сибирскую язву 7. Режим работы в лабораториях, работающих с возбудителем сибирской язвы Приложение 1. Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы Приложение 2. Приготовление рабочих растворов и реагентов Приложение 3. Критерии интерпретации результатов исследования B.antharacis пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и величин МПК (мг/л) антибактериальных препаратов Приложение 4. Отличительные признаки штаммов сибиреязвенного микроба различных типов Приложение 5. Диагностические препараты, применяемые для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы Приложение 6. Устойчивость B.antharacis к физическим и химическим факторам Приложение 7. Иллюстрации к методическим указаниям «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» Приложение 8. Временной график выполнения лабораторных исследований на сибирскую язву |
| Разработан: | Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФГУЗ РосНИПЧИ Микроб ФГУН Центральный НИИ эпидемиологииРоспотребсоюза ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии |
| Утверждён: | 29.07.2008 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации |
| Издан: | Роспотребнадзор (2009 г. ) |
| Расположен в: | |
| Заменяет собой: |
|
| Нормативные ссылки: |
|
«Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды»Источник
Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку тестов идентификации, метод флюоресцирующих антител, ПЦР (полимеразно-цепную реакцию), постановку биопробы и, при необходимости, реакции преципитации. У человека, кроме того, необходима постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном антраксином.
а) Взятие материала от животных. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют ухо или мазок крови, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного, вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки, от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани, заглоточные, подчелюстные, а также другие лимфатические узлы.
б) Взятие материала от человека. Для бактериологического исследования забор материала у больных должен производиться по возможности до начала лечения. При кожной форме заболевания необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Затем содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем, отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным физиологическим раствором, фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом. При всех формах заболевания берут кровь в объеме 1-2 мл из вены. 1-2 капли крови непосредственно у постели больного засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2-7,5). При висцеральных формах сибирской язвы и менингите отбирают спинномозговую жидкость в количестве 0,5 мл в стерильную пробирку.
При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке полости носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем его слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с физиологическим раствором. Погрузив рабочую часть зонда в физраствор, вращают зонд в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
Для исследования методом ПЦР забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Содержимое везикул, карбункулов в объеме 0,1-0,3 мл и фрагменты струпов массой 10,0-100,0 мг помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1-0,2 мл транспортной среды. Спинномозговую жидкость после пункции одноразовой пункционной иглой отбирают в количестве 0,5 мл в стерильную пробирку типа Эппендорф с завинчивающейся крышкой или пробирку объемом 1,5 мл с защелкой.
Транспортирование материала для исследования методом ПЦР осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8°С в течение 6 ч (кровь — в течение 1 сут., плазму и сыворотку — в течение 3 сут.), в замороженном виде — в течение 1 сут. Недопустимо замораживание образцов цельной крови.
в) Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.
г) Отбор проб шерсти. Для исследования шерсть отбирают из разных мест не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.
д) Отбор проб кожи. Берут кусочки кожи размером 3×3 см с периферических участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.
е) Отбор проб почвы. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников — на глубине до 2 м при помощи почвенных буров.
ж) Смывы с объектов внешней среды. Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя при помощи стерильного тампона, смоченного стерильной водой. Площадь смыва одним тампоном — около 100 см2. Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильной водой (5 мл) и закрывают пробкой.
Отбор проб для исследования методом ПЦР осуществляется аналогично.
з) Направление материала на исследование. Патологический материал помещают в стерильную посуду (пробирки, банки). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью «мазок не фиксирован». На упаковке материала от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки, которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Все пробы нумеруют, упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «верх, осторожно» и направляют в лабораторию с нарочным.
В сопроводительном документе к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала; для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительному документу прилагают опись проб и место каждой пробы.
и) Подготовка проб к бактериологическому исследованию. Кусочки органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают 1-5 мл физиологического раствора, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пастеровскую пипетку и переносят в пробирку или колбочку.
Воду с илистыми частицами фильтруют через 2 слоя марли, чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (№3). Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем, затем смывают 1-2 мл физиологического раствора и эту взвесь используют для исследования.
Тампоны, которыми делают смывы с объектов внешней среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость подвергают исследованию.
Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90-100 г почвы, помещают в колбу, заливают физиологическим раствором или дистиллированной водой из расчета получения 15-20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 25 мин, дают отстояться 1-2 мин и надосадочную жидкость переносят в пробирку для дальнейшего исследования. Пробы пищевых продуктов или кормов готовят аналогично.
Для проб из шкур кусочки массой 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают 1-2 мл физиологического раствора. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20°С на 2-3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, затем мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки.
От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают физиологическим раствором. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 10 мин, от грубых частиц можно освободиться путем фильтрации через 2-3 слоя марли.
Для избавления от посторонней микрофлоры пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов подвергаются термической обработке на водяной бане при 80°С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного из патологического материала, мяса животных и пр., где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.
к) Предварительная обработка проб для исследования при помощи ПЦР. Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. После этого сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. Затем сыворотку в объеме 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером или пастеровскими пипетками в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Сыворотка, содержимое везикул, отделяемое язв, фрагменты отторгнутого струпа, мазки из полости носа и спинномозговая жидкость не требуют предварительной обработки. Воду, смывы с объектов внешней среды, пробы почвы, пищевых продуктов или кормов, шкур, шерсти предварительно обрабатывают так же, как для бактериологического исследования, отбирая для исследования методом ПЦР 0,1-0,2 мл водной фазы образцов.
— Читать далее «Бактериоскопия возбудителя сибирской язвы (B. anthracis)»
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 20.12.2019
Источник