Микроскопия при сибирской язве

Bacillus

anthracis неподвижная, грамположительная (в молодых и старых культурах

встречаются и грамотрицательные клетки), образующая капсулу (в организме или

при культивировании на искусственных питательных средах с большим содержанием

нативного белка и СО2) и спору палочка, размером 1-1,3 х 3,0-10,0 мкм. При

температуре ниже 12 и выше 42 оС, а также в живом организме или невскрытом

трупе, в крови и сыворотке животных споры не образуются. В окрашенных препаратах

из крови и тканей больных или погибших от сибирской язвы животных бактерии

располагаются одиночно, попарно и в виде коротких цепочек по 3-4 клетки; концы

палочек, обращенных друг к другу, прямые, резко обрубленные, свободные — слегка,

закругленные. Иногда цепочки имеют форму бамбуковой трости.В мазках из культур

на плотных и жидких питательных средах палочки располагаются длинными цепочками.

Культивирование.

Bacillus

anthracis по способу дыхания относят к факультативным анаэробам, хорошо

растет на универсальных средах (МПБ, МПА, МПЖ, картофеле, молоке).Оптимальная

температура роста на МПА 35-37oС, в бульоне 32-33oС.

При температуре ниже 12 и выше 45oС не растет. Оптимум рН сред

7,2-7,6. На поверхности МПА в аэробных условиях при температуре 37oС

17-24-часовые культуры состоят из серовато-беловатых тонкозернистых с серебристым

оттенком, похожих на снежинки колоний, имеющих шероховатый рельеф и характерных

для типичных вирулентных штаммов (R-форма). Диаметр колоний не превышает 3-5

мм.На сывороточном агаре и свернутой лошадиной сыворотке в присутствии 10-50%

углекислоты колонии гладкие полупрозрачные (S-форма), а также слизистые (мукоидные),

тянущиеся за петлей (М-форма), состоящие из капсульных палочек.В МПБ Bacillus

anthracis через 16-24 ч на дне пробирки образует рыхлый белый осадок,

надосадочная жидкость остается прозрачной, при встряхивании бульон не мутнеет,

осадок разбивается на мелкие хлопья (R-форма).При посеве в столбик желатина

на 2-5-е сут появляется желтовато-белый стержень. Культура напоминает елочку,

перевернутую верхушкой вниз. Постепенно верхний слой желатин начинает разжижаться,

принимая сначала форму воронки, затем мешочка.Bacillus anthracis

при росте в молоке вырабатывает кислоту и через 2-4 дня свертывает его и пептонизирует

сгусток.Возбудитель хорошо размножается в 8-12-суточных куриных эмбрионах,

вызывая их гибель на 2-4 дней с момента заражения.

Биохимические свойства.

Ферменты Bacillus anthracis: липаза, диастаза, протеаза, желатиназа,

дегидраза, цитохромоксидаза, пероксидаза, каталаза, лецитиназа и др.Ферментирует

с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу

и декстрин. На средах с глицерином и салицином возможно слабое кислотообразование.

Арабинозу, рамнозу, галактозу, маннозу, раффинозу, инулин, маннит, дульцит,

сорбит, инозит не сбраживает. Утилизирует цитраты, образует ацетилметилкарбинол

(реакция Фогеса — Проскауэра положительная). Выделяет аммиак. Редуцирует метиленовый

синий и восстанавливает нитраты в нитриты. Некоторые штаммы образуют сероводород.

Токсинообразование.

Bacillus anthracis образует сложный экзотоксин, состоящий из трех

компонентов: эдематогенный фактор (ЕF), протективный антиген (РА) и летальный

фактор (LF) или факторы I, II, III. Эдематогенный фактор вызывает местную

воспалительную реакцию — отек и разрушение тканей. Протективный антиген —

носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием. Летальный

фактор в смеси со протективным вызывает гибель крыс, белых мышей и морских

свинок.Каждый из трех факторов обладает выраженной антигенной функцией и серологически

активен.Инвазивные свойства микроба обусловлены капсульным полипептидом d-глутаминовой

кислоты и экзоферментами.

Антигенная структура.

В состав антигенов Bacillus anthracis входят неиммуногенный соматический

полисахаридный комплекс и капсульный глутаминполипептид. Полисахаридный антиген

не создает иммунитета у животных и не определяет агрессивных функций микроорганизма.

Устойчивость.

В невскрытом трупе вегетативная клетка микроба разрушается в течение 2-3

сут, в зарытых трупах сохранятся до 4 дней. В замороженном мясе при минус

15oС жизнеспособна 15 дней, в засоленном мясе — до 1,5 мес. В навозная

жиже, смешанной с сибиреязвенной кровью, погибает через 2-3 ч, споры же остаются

в ней вирулентными в течение месяцев. В запаянных ампулах с бульонными культурами

могут оставаться жизнеспособными и вирулентными до 63 лет, в почве — более

50 лет.Спирт, эфир, 2 %-ный формалин, 5 %-ный фенол, 5-10 %-ный хлорамин,

свежий 5 %-ный раствор хлорной извести, перекись водорода разрушают вегетативные

клетки в течение 5 мин. Этиловый спирт 25-100 % убивает споры в течение 50

дней и более, 5 %-ный фенол, 5-10%-ный раствор хлорамина — от несколько часов

до нескольких суток, 2 %-ный раствор формалина — через 10-15 мин, 3%-ный раствор

перекиси водорода — через 1 ч, 4 %-ный раствор перманганата калия — через

15 мин, 10 %-ный раствор гидроокиси натрия — через 2 ч.Вегетативные клетки

при нагревании до 50-55oС гибнут в течение 1 ч, при 60 oС

— через 15 мин, при 75 oС — через 1 мин, при кипячении — мгновенно.При

медленном высушивании наступает спорообразование и микроб не гибнет. При минус

10oС бактерии сохраняются 24 дня, при минус 24oС — 12

дней.Воздействие прямого солнечного света обезвреживает бактерии через несколько

часов.Сухой жар при температуре 120-140oС убивает споры через 2-3

ч, при 150oС — через 1 ч, текущий пар при 100oС — через

12-15 мин, автоклавирование при 110oС — за 5-10 мин, кипячение

— через 1 ч.Возбудитель сибирской язвы проявляет высокую чувствительность

к пенициллину, хлортетрациклину и левомицетину, а также к лизоциму. Бактериостатическим

эффектом на протяжении 24 ч обладает свежевыдоенное молоко коров.

Патогенность.

К возбудителю сибирской язвы восприимчивы все виды млекопитающих. Чаще болеют

овцы, крупный рогатый скот, лошади, козы, буйволы, верблюды и северные олени,

могут заражаться ослы и мулы. Свиньи менее чувствительны. Среди диких животных

восприимчивы все травоядные. Известны случаи заболевания собак, волков, лисиц,

песцов, среди птиц — уток и страусов.

Патогенез.

Заражение животных происходит преимущественно алиментарно. Через поврежденную

слизистую пищеварительного тракта микроб проникает в лимфатическую систему,

а затем в кровь, где фагоцитируется и разносится по всему организму, фиксируясь

в элементах лимфоидно-макрофагальной системы, после чего снова мигрирует в

кровь, обусловливая септицемию.Капсульное вещество ингибирует опсонизацию,

в то время как экзотоксин разрушает фагоциты, поражает центральную нервную

систему, вызывает отек, возникает гипергликемию и повышается активность щелочной

фосфатазы.В терминальной фазе процесса в крови снижается содержание кислорода

до уровня, несовместимого с жизнью.

Лабораторная диагностика.

Для лабораторного исследования на сибирскую язву направляют ухо павшего животного.

Бактериоскопия. Из патологического материала для микроскопии готовят

мазки, часть красят по Граму и обязательно на капсулы по Михину и Ольту. Обнаружение

типичных по морфологии капсульных палочек является важным диагностическим

признаком.Посев на питательные среды. Исходный материал засевают в МПБ и на

МПА (рН 7,2-7,6), инкубируют посевы при температуре 37oС в течение

18-24 ч, при отсутствии роста их выдерживают в термостате еще 2 сут.Биологическая

проба. Осуществляется на белых мышах, морских свинках, кроликах, одновременно

с посевом материала на питательные среды. Белых мышей заражают подкожно в

заднюю часть спины (по 0,1-0,2 мл), морских свинок и кроликов — под кожу в

область живота (по 0,5-1,0 мл). Мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки

и кролики — через 2-4 сут. Павших животных вскрывают, делают мазки и посевы

из крови сердца, селезенки, печени и инфильтрата на месте инъекции исследуемого

материала.Идентификация. Возбудителя сибирской язвы следует дифференцировать

от сапрофитных бацилл: B. cereus, B. megaterium, B. mycoides и B.

subtilis на основе главных и дополнительных признаков. К главным признакам

относятся патогенность, капсулообразование, тест «жемчужного ожерелья», лизабельность

фагом, иммунофлюоресцентный тест. Дополнительными являются подвижность, отсутствие

гемолиза, лецитиназная активность, образование фосфатазы.

Тест	B. anthracis	B. cereus, B. megaterium, B. mycoides, B. subtilis
Патогенность	Патогенна для лабораторных животных	Не патогенны для лабораторных животных, за исключением B.cereus (при внутрибрюшинном заражении белых мышей).
Капсулообразование	Образует массивную с четкими контурами капсулу.	Капсулу не образуют.
«Жемчужное ожерелье»	На агаре с пенициллином возбудитель растет в виде цепочек, состоящих из шарообразных форм, напоминающих ожерелье из жемчуга.	Феномен «жемчужного ожерелья» отсутствует.
Лизабельность фагом	Лизируется сибиреязвенный фагом.	Лизис сибиреязвенный фагом отсутствует.
Иммунофлюоресцентный тест1	Положительный	Отрицательный
Подвижность	Неподвижна	Подвижны
Гемолитеческая активность2	Как правило не гемолизирует эритроциты барана, или лизирует очень медленно.	Гемолизируют эритроциты барана.
Лецитиназная активность	Желток куриного яйца свертывает медленно или вообще не свертывает (левый сектор)	B.cereus интенсивно синтезирует лецитиназу (верхний сектор)
Образование фосфатазы	Отсутствует	Имеется

1 — ориентировочный метод и требует дополнительного

изучения вирулентности, капсулообразования, фагочувствительности.
2 — признак вариабелен у разных штаммов.

Серологическое исследование.

Для обнаружения сибиреязвенных антигенов при исследовании кожевенного и мехового

сырья, загнившего патологического материала, а также свежего патологического

материала и серологической идентификации выделенных культур применяют реакцию

преципитации по Асколи.В качестве серологического теста, главным образом для

изучения антигенного спектра Bacillus anthracis, применяют реакцию диффузионной

преципитации (РДП).Для выявления свежих случаев и ретроспективной диагностики

сибирской язвы у человека предложен аллерген антраксин (Э. Н. Шляхов, 1961).

Им выявляют и специфическую поствакцинальную сенсибилизацию у сельскохозяйственных

животных.

Иммунитет.

Формирование иммунитета инфекции по типу антитоксического обуславливает протективный

антиген.В настоящее время защитные антитела обнаружены при помощи РСК, РДП

и непрямого варианта метода флюоресцирующих антител.В результате естественного

заражения и переболевания сибирской язвы у животных возникает длительный иммунитет.С

целью активная защита животных от сибирской язвы применяют живые споровые

сибиреязвенные вакцины: вакцина СТИ (иммунитет наступает через 10 дней и длится

не менее 12 мес), вакцина из штамма № 55 (иммунитет наступает через 10 дней

и сохраняется не менее 1 года).Для лечения и пассивной профилактики применяют

противосибиреязвенную сыворотку и глобулин. Иммунитет наступает через несколько

часов и сохраняется до 14 дней.